Canolfan Edward Llwyd

Gweithio â DNA

ENGLISH

Cartref

Dosbarthiad

Geirfa

Mae darganfyddiadau’r chwyldro genetig wedi rhoi i fycolegwyr arfau pwerus iawn ar gyfer dadansoddi bioleg eu dewis ffwng, ac ymchwilio rôl ffyngau mewn natur, clefydau a biotechnoleg. Gadwch i ni ystyried rhai o’r dulliau allweddol a ddefnyddir i astudio bioleg folecylaidd ffyngau:

Yr Adwaith Cadwynol Polymeras: Mwyhau DNA ar gyfer astudiaethau fforensig, meddygaeth neu ymchwil ffyngaidd

Mae’r Adwaith Cadwynol Polymeras (Polymerase Chain Reaction, PCR) yn broses sy’n defnyddio polymeras DNA sy’n wrthsafol i wres i gynhyrchu biliynau o gopïau o DNA, hyd yn oed o ddim ond un copi gwreiddiol! Gadwch i ni weld sut mae gwyddonwyr yn gwneud hyn:

Llun o biped yn cael ei defnyddio i baratoi adweithyddion PCR.

Yn gyntaf, mae angen echdynnu’r DNA o sampl o gelloedd. Gwneir hyn drwy dorri’r gelloedd â glanedydd a dyddodi’r DNA.

Nesaf, mae angen i ni baratoi cymysgedd o’r cemegolion a’r polymeras DNA y mae eu hangen i wneud y PCR. Mae’r rysáit yn cynnwys byffer, magnesiwm clorid (sy’n helpu’r polymeras i weithio), y pedwar niwcleotid, dau breimydd sy’n marcio’r dilyniant DNA i gael ei gopïo, a polymeras DNA gwres-sefydlog a elwir yn HTaq (o facteria sy’n byw mewn ffynhonnau poethion). Mae’r holl gymysgedd yn cael ei wanedu â dw^r. Drwy’r broses, cymerir gofal mawr i osgoi llygru’r cymysgedd â DNA crwydr o’r lab neu o’r gwyddonydd sy’n gwneud y PCR.

Unwaith bod yr adweithyddion wedi’u cymysgu a rhai o’r sampl DNA wedi’i ychwanegu, rhoddir yr adwaith mewn cylchydd thermol sydd wedi’i raglenni i:
- wahanu’r ceinciau DNA drwy eu cynhesu
- oeri wedyn i alluogi’r preimyddion i rwymo
- cynhesu i’r tymheraidd optimaidd ar gyfer HTaq, a hwnnw'n llenwi’r bylchau rhwng y preimyddion.

Llun o beiriant PCR.

Mae pob cylchred o doddi, rhwymo a synthesu yn dyblu nifer y darnau penodol o DNA. Os caniateir y broses i barhau am 20, 30 neu 40 cylchred, mae nifer y darnau a gynhyrchir yn aruthrol! I bob diben, mae PCR yn troi nodwydd mewn tas wair yn das wair o nodwyddau!

Unwaith y bydd y PCR wedi gorffen, gallwn ni gymryd rhai o’r cymysgedd adwaith a’i ddadansoddi gan ddefnyddio electrofforesis gel:

Llun o samplau mewn piped yn barod i'w rhoi mewn gel.

Mae’r broses hon yn gwahanu darnau DNA yn ôl eu hyd. Mae gwefr negatif gan y grwpiau ffosffad ar y moleciwl DNA, sy’n golygu y byddant yn cael eu denu tuag at electrod positif (cathod) pan fyddant mewn maes trydanol. Os byddwn yn rhoi’r DNA mewn gel (a wneir o agaros neu bolyacrylamid) mae hyn yn arafu darnau DNA mawr yn fwy na darnau DNA bach:

Ar ôl i ni ddiffodd y maes trydanol, gallwn ni staenio’r gel â chemegolyn sy’n tywynnu. Pan fyddwn ni’n rhoi’r gel mewn golau uwchfioled, mae hyn yn dangos i ni ble mae’r bandiau DNA yn y gel:

Llun o gel ar beiriant golau uwchfioled.

Gallwn ni ddefnyddio ‘ysgolion’ o ddarnau DNA o feintiau cynyddol i ddweud wrthym pa mor fawr yw’r darnau DNA o’n sampl. Mae’r ‘ysgol’ a ddangosir uchod yn cynyddu fesul 100 bas-pâr. Os bydd ein PCR wedi gweithio byddwn ni’n medru gweld darnau o feintiau penodol ar y gel. Yma, gallwn ni weld bod yr ail sampl yn cynnwys ein DNA targed, a bod hwnnw tua 600 bas-pâr o hyd:

Llun o gel PCR gydag un band o'r sampl yn weladwy, ac 'ysgol' DNA ar y dde.

Ar ôl i ni ddangos bod ein PCR wedi gweithio, gallwn ni ddefnyddio’r DNA rydym wedi’i greu i wneud clonio, neu i archwilio ‘olion bysedd’ neu ddilyniant y DNA.

Mewn mycoleg feddygol, mae presenoldeb band yn y lle iawn yn aml yn dystiolaeth o bathogen ffyngaidd penodol. Mae PCRau a gynlluniwyd yn ofalus yn aml yn benodol iawn ac yn sensitif iawn, i’r fath raddau fel bydd printio llun o’r gel yn ddigon i ateb y cwestiwn.

ii)

Mapio Cyfyngiad ac 'olion bysedd' DNA

Mae rhai ensymau, a elwir yn ensymau cyfyngiad ('restriction enzymes'), yn torri DNA ar safleoedd cyfyngiad penodol. Ar gyfer yr ensym HindIII (y trydydd ensym cyfyngiad i gael ei arunigo o Hemophilus influenzae hil d) y safle cyfyngiad yw:

5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’

Os bydd gennym ddarn DNA o faint penodol, efallai wedi’i arunigo gan ddefnyddio PCR, gallwn ni ddefnyddio ensymau cyfyngedig i greu map o’r darn hwnnw. Beth rydym yn gwneud yw gweld beth yw nifer a lleoliad y safleoedd cyfyngiad, drwy ddefnyddio’r ensymau i dorri’r DNA a defnyddio electrofforesis gel wedyn i wahanu’r darnau. Gelwir hyn yn fapio cyfyngiad.

Y cam cyntaf yw ychwanegu ensym a byffer i’r samplau DNA a gwanedu’r cymysgedd â dw^r i’r crynodiad cywir. Bydd yr ensym wedyn yn gwneud ei waith os byddwn yn cynhesu’r adwaith i dymheredd y corff am ychydig o oriau.

Llun yn dangos y cynhwysion ar gyfer torri DNA ag ensym cyfyngiad, wedi eu cadw mewn rhew cyn eu defnyddio.

Gellir defnyddio mapio cyfyngiad i gael hyd i ‘olion bysedd’ DNA drwy ddull a elwir yn Amryffurfedd Hyd Darnau Cyfyngiad (‘Restriction Fragment Length Polymorphism’, RFLP). Seilir hwn ar y syniad y gall mwtaniadau greu neu ddileu safleoedd cyfyngiad, neu newid lleoliad cymharol safle. Gan fod mwtaniadau yn newidiadau etifeddol mewn deunydd genetig, gall rhai RFLPau fod yn ddangosyddion
tras. Felly, bydd rhai aelodau o boblogaeth â safle cyfyngiad ar bwynt X, ac eraill ar bwynt Y, ac eraill eto ar bwynt Z, ac efallai na fydd y safle cyfyngiad yn bresennol o gwbl mewn aelodau eraill. Gelwir y gwahanol ffurfiau yn alelau ac os bydd mwy nag un alel mewn poblogaeth fel elwir hyn yn amryffurfedd (‘polymorphism’). Os byddwn ni’n edrych ar nifer o alelau ar draws genom cymhleth, mae’r tebygolrwydd y bydd dau unigolyn penodol â’r un patrwm alel RFLP yn fach iawn. Mae hyn yn cael ei helpu gan y ffaith fod pobl yn ddiploid (â dwy set o gromosomau), a bod parau o gromosomau yn medru dangos gwahanol RFLPau. Mae’r holl amrywiaeth alelig hon yn ffurfio cynsail y dechneg ‘olion bysedd’ DNA sy’n cael ei defnyddio mewn astudiaethau dosbarthiad neu, yn fwy amlwg, mewn geneteg fforensig.

Er hynny, mewn genom cymhleth bydd nifer fawr o safleoedd cyfyngiad nad ydynt yn amryffurf, a’r rheiny’n gwneud y gel electrofforesis yn anodd i’w ddarllen. I gael gwared â’r rhain, gallwn ni naill ai defnyddio PCR i fwyhau ein parthau targed i roi signal gwell, neu ddefnyddio Blotio Southern.

Cafodd Blotio Southern ei enwi ar ôl y sawl a’i dyfeisiodd, yr Athro Ed Southern. Yn y dechneg hon mae DNA yn cael ei sugno allan o’r gel a’i bobi ar bilen neilon, caniateir wedyn i chwiliedydd (‘probe’) rhwymo i unrhyw ddilyniannau cyflenwol ar y DNA pilen-rwymedig, ac ar ôl hynny ceir gwared ag unrhyw chwiliedydd sydd ddim wedi rhwymo yn gywir. Gellir labelu’r chwiliedydd â ffosffadau ymbelydrol neu â DNA sydd wedi’i dagio’n fflwroleuol. Gallwn wedyn weld lleoliad y chwiliedydd gan ddefnyddio naill ai awtoradiograffau neu sganwyr fflwroleuedd:

Llun o gel RFLP gyda thri sampl yn y canol a DNA 'ysgol' ar yr ochrau.

RFLP fflwroleuol. Mae safle cyfyngiad yn y sampl cyntaf (ail lôn o’r chwith)
nad yw'n bresennol yn y ddau nesaf. Achos wedi’i gau.

Er hynny, nid yw RFLP yn arbennig o ddefnyddiol ar gyfer astudiaethau fforensig, hyd yn oed pan ddefnyddir ef ar y cyd â PCR. Yn ddiweddar mae gwyddonwyr fforensig wedi troi at ddull awtomataidd (dadansoddiad microloeren, ‘microsatellite analysis’) sy’n medru defnyddio olion microsgopig o DNA i brofi achos. I wneud hyn, defnyddir nifer o barau preimydd PCR fflwroleuol i edrych ar nifer o leoliadau (loci) ar draws y genom. Ar hyn o bryd, archwilir 14 locws mewn math arbennig o PCR a elwir yn ‘Single Generation Multiplex PCR’ (SGM PCR).

Nid yw loci microloeren yn rhyw fath o deledu digidol newydd, ond yn hytrach yn ddarnau byrion o DNA sy’n cael eu hailadrodd. Mae’r microloerenni mwyaf defnyddiol, sef loci Ailadroddiad Tandem Byr (‘Short Tandem Repeat’, STR), wedi’u taenu drwy’r genom dynol ac maent yn ymddangos fel hyn:
	5’- CACACACACACACACA -3’ (08 ailadroddiad)
Mewn person arall, gall hwn fod yn:
	5’-CACACACACACACACACACACACA-3’ (12 ailadroddiad)

Mae nifer yr ailadroddiadau CA yn newid hyd y darn DNA sy’n cael ei fwyhau gan SGM PCR; gellir canfod hyn drwy electrofforesis cydraniad uchel a rhoi iddo rhif sy’n cyfateb i nifer yr ailadroddiadau. Gall proffil STR 14 locws ymddangos yn debyg i hwn:

(08) (23) (12) (28) (09) (07) (11) (20) (14) (28) (14) (34) (06) (39).

O wybod bod cynifer â 50 alel ar bob locws, mae’r tebygolrwydd y bydd proffil unigolyn yn union yr un fath â phroffil rhywun arall (ar wahân i efell unfath), gan gymryd bod amlder yr holl alelau yn gyfartal, yn 0.02 i’r 14ed radd, sef tua 0.0000000000000000000000016384! Mae hyn yn golygu y gellir fod yn eithaf hyderus, yn y rhan fwyaf o achosion, wrth ddyfarnu rhywun yn euog o drosedd ar sail tystiolaeth DNA.

Edrychodd un astudiaeth ar ddeg locws marciwr o’r fath yn y genom dynol, gan gymharu amledd pobl â’r un nifer o ailadroddiadau ar y loci penodol. Dyma’r canlyniadau ar gyfer cyfran yr Almaenwyr a’r Awstriaid a brofwyd gydag un marciwr, D2S1338:

D2 D2S1338 - Almaenwyr		D2 D2S1338 - Awstriaid
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26	0.005 0.005 0.180 0.060 0.095 0.125 0.035 0.055 0.105 0.155 0.110 0.025	15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26	Dim 0.041 0.215 0.090 0.122 0.141 0.060 0.025 0.095 0.095 0.103 0.019

Data Poblogaeth o’r cit AmpF/STR SGM gyda PCR, mewn Almaenwyr ac Awstriaid.
Forensic Science International 132 (2003) 84-86

Fel y gallwch weld, mae nifer o wahaniaethau sy’n awgrymu y gallem ganfod cenedlaetholdeb rhywun ar sail eu proffiliau STR. Dangosodd astudiaeth ddiweddar y posibilrwydd o wneud hyn gyda dynion Cymreig a Seisnig.

iii)

Clonio DNA

Cyn dyddiau PCR, os oedd biolegwyr molecylaidd ffyngau am gael hyd i faint mawr o DNA, byddent yn defnyddio clonio molecylaidd. Mae’r broses hon yn dal i fod o ddefnydd ar gyfer dilyniannu DNA a chynhyrchu proteinau estron (gweler yr enghraifft am inswlin). I wneud hyn, byddem yn trin ein DNA targed ag ensym cyfyngiad a fyddai’n rhoi pennau gludiog. Pe baem yn torri fector â’r un ensym, byddem yn cael pennau gludiog cyfatebol. Gallem wedyn selio’r DNA targed a’r fector at ei gilydd gan ddefnyddio ensym a elwir yn ligas DNA.

Mae’r fector a ddefnyddir yn amrywio yn ôl y dasg benodol, ond fel arfer fe ddefnyddir plasmidau (dolenni o DNA bacteriol neu furum sy’n medru atgynhyrchu y tu allan i brif genom yr organedd). Mae plasmidau modern wedi’u hadeiladu’n artiffisial ac maent yn cynnwys pedair nodwedd allweddol:

a)	Tarddbwynt dyblygiad sy’n gweithio yn yr organedd lletyol – dyma ble mae dyblygiad DNA yn cychwyn.
b)	Safle clonio lluosol neu ‘polylinker’ – mae’r safle hwn yn cynnwys nifer o safleoedd cyfyngiad i ganiatáu defnyddio llawer o ensymau cyfyngiad.
c)	Genyn gwrthsafiad i wrthfiotig. Mae hwn yn galluogi bacteria sy’n cynnwys y plasmid i dyfu ar agar sy’n cynnwys gwrthfiotigau (lle byddai bacteria eraill yn cael eu lladd). Fel arfer fe ddefnyddir antibiotigau nad ydynt o ddefnydd mawr mewn meddygaeth.
d)	Genyn ar gyfer ensym sy’n cynhyrchu lliw, sy’n rhedeg ar draws y ‘polylinker’. Fel arfer, defnyddir beta galactosidas. Mae hwn yn cymryd deilliad o galactos ac yn ei addasu i roi lliw glas. Mae celloedd a chanddynt galactosidas gweithiol yn gwneud cytrefi gleision. Ond os torrir y ‘polylinker’ drwy fewnosod y DNA targed, ni fydd yr ensym yn gweithio bellach ac fe geir cytref wen. Felly, gallwn ni weld pa gelloedd sy’n cynnwys y plasmid, a pha rai sy’n cynnwys ein DNA targed hefyd.

Unwaith y bydd y plasmid wedi’i seilio, gallwn ni roi sioc drydan i gelloedd (fel arfer naill ai’r rhywogaeth facteriol Escherichia coli neu’r burum Saccharomyces cerevisiae) i gyflwyno’r DNA, ac ar ôl twf ar gyfrwng meithrin detholus (gydag ychwanegiad gwrthfiotigau a deilliad galactos) gallwn ni weld pa gytrefi sy’n cynnwys y plasmid a hefyd ein DNA targed. Gallwn wedyn arunigo’r DNA plasmid i gael ei ddadansoddi:


Dysgl agar sy’n cynnwys E. coli wedi’i addasu’n enetig. Nid yw’r cytrefi gleision o ddiddordeb, gan eu bod yn cynnwys y plasmid yn unig, ond mae’r rhai gwyn yn cynnwys y plasmid a hefyd y DNA ffyngaidd wedi’i gyflwyno’n llwyddiannus.

iv)

Dilyniannu DNA

Unwaith bod gennym DNA wedi’i fwyhau â PCR neu DNA wedi’i glonio gallwn ni weithio allan beth yw’r dilyniant niwcleotidau. Y dyddiau hyn mae biolegwyr molecylaidd ffyngau yn tueddu i ddefnyddio peiriannau awtomataidd, drud iawn (£120,000 yr un, gyda chludiad a phacediad) a elwir yn ddilynianwyr i ddadansoddi cynhyrchion adweithiau dilyniannu.

Mae’r dull a ddefnyddir wedi’i addasu o’r un a ddyfeisiwyd gan Fred Sanger yng Nghaergrawnt yn y chwe degau (‘Fluorescent Primer Chain Termination’). Mae preimydd wedi’i labelu’n fflwroleuol yn gweithredu i gyfarwyddo synthesis DNA â pholymeras DNA. Defnyddir y pedwar niwcleotid i adeiladu DNA mewn modd tebyg i PCR, gydag un gwahaniaeth pwysig...

Mae gan niwcleotidau DNA arferol grw^p alcohol yn y safle 3’. Mae hwn yn cydio yn grw^p ffosffad 5’ y niwcleotid nesaf, gan alluogi’r gadwyn niwcleotidau i dyfu. Ond mae cymysgeddau dilyniannu Sanger yn cynnwys maint bach o niwcleotidau heb yr alcohol 3’ (gelwir y rhain yn ddeuddiocsiniwcleotid triffosffadau neu ddNTPau, o’u cyferbynnu â diocsiniwcleotid triffosffadau neu dNTPau). Mae hyn yn ‘jamio’ synthesis DNA yn y safle lle mae’r ddNTP yn cael ei ychwanegu. Gan hynny, mae angen pedwar tiwb, preimyddion â phedwar gwahanol fath o fflwroleuedd, a phedwar cymysgedd ddNTP. Os ydym yn cymryd y cymysgedd a ddefnyddir i ddilyniannu safleoedd adenin, bydd gennym breimydd â thag fflwroleuol gwyrdd, polymeras DNA, dCTP, dGTP, dTTP, rhywfaint o dATP, a rhywfaint o ddATP. Mae’r cymysgedd terfynu thymin â phreimydd fflwroleuol coch, polymeras DNA, dCTP, dGTP, dATP, rhywfaint o dTTP, a rhywfaint o ddTTP. Mae’r patrwm yr un fath ar gyfer y cymysgeddau terfynu sytosin a gwanin.

Llun yn dangos cynhwysion ar gyfer adwaith dilyniannu, wedi eu cadw mewn rhew cyn eu defnyddio.
Yr holl gydrannau ar gyfer pedwar cymysgedd terfynu dilyniant,
ar wahân i breimyddion fflwroleuol â’r DNA templed.

Y canlyniad yw ein bod ni’n cael darnau o DNA o feintiau cynyddol, a’r rheiny bob amser yn gorffen â’r niwcleotid ddNTP. Pan fyddwn yn cydgymysgu’r pedwar adwaith dylai fod gennym set o ddarnau sy’n cynyddu mewn hyd, fesul niwcleotid, hyd at 2000 niwcleotidau o hyd. Gellir wedyn ddarllen y dilyniant gan ddefnyddio dilyniannwr electrofforesis capilari. Mae hwn yn gwahanu darnau DNA bychain â chydraniad uchel iawn gan ddefnyddio foltedd uchel iawn mewn tiwb gwydr sy’n cynnwys byffer, ac yn defnyddio sganiwr laser i ganfod y preimydd fflwroleuol. Gellir dadansoddi 96 sampl o fewn munudau, a’r canlyniadau yn cael eu dangos ar gyfrifiadur:

Diagram o ganyliniadau dilyniant. Dilyniant a ddarllenwyd o Chromas 1.45, Conor McCarthy

Mewn prosiectau dilyniannu genom mawrion, mae’r holl broses wedi’i hawtomeiddio, o glonio ac arunigo’r DNA hyd at baratoi’r cymysgeddau a rhedeg y dilyniannwr. Defnyddir meddalwedd cyfrifiadur i alinio gwahanol setiau o ddilyniannau i gynhyrchu un llwybr teilsio hir sy’n cynnwys yr holl ddilyniant o un pen y genom i’r llall.

Dilyniannwyd yr holl genom dynol gan y Prosiect Genom Dynol, a hynny flynyddoedd cyn y dyddiad targed. Ond nid yw gwybod y dilyniant yn ddefnyddiol iawn, ar ei ben ei hun, a rhaid archwilio’r dilyniant â dadansoddiad cyfrifiadur cymhleth er mwyn adnabod genynnau a nodweddion eraill o ddiddordeb. Unwaith y bydd y fath anodiad wedi’i gwblhau, bydd gennym ddealltwriaeth well o’r hyn y mae’r genom yn ei gynrychioli.

Mae genomau ffyngau hefyd yn cael eu dilyniannu, ac mae cronfa ddata genom Saccharomyces cerevisiae yn cael ei dangos ar y We.

Mae genomeg wedi ysbrydoli creu proteomeg, metabolomeg a gwyddorau "-omeg" eraill. Mae proteomeg yn edrych ar gyfanswm proteinau rhywogaeth (ei phroteom) ac mae’r metabolomegwyr yn edrych ar sut mae metabolaeth organedd yn gweithio.

Bioleg Folecylaidd: DNA sy'n gwneud RNA sy'n gwneud Protein
Gweithio â DNA (y tudalen hwn - top)
Organedd Model: Saccharomyces

Brig y tudalen

Testun a diagramau Hawlfaint © y cyfranwyr a PCA 2005- oni nodir yn wahanol. Datblygwyd y safle hwn gyda chefnogaeth HEFCW fel rhan o weithgareddau Canolfan Edward Llwyd. Cysylltwch â ni. Darllenwch y gwadiad os gwelwch yn dda.